Identification of gene regulatory networks controlling sulfate deficiency response in solanum lycopersicum

Abstract

El sulfato (forma más disponible del azufre) es un macronutriente esencial requerido para el crecimiento, desarrollo y productividad de las plantas. La deficiencia de sulfato causa reducciones significativas en la biomasa vegetal, afectando la fotosíntesis lo que conlleva a perdidas en el rendimiento agrícola. Mientras que la mayoría de los estudios del transcriptoma enfocados en la deficiencia de sulfato se han centrado en Arabidopsis thaliana, el conocimiento es limitado en especies usadas como cultivos. El tomate (Solanum lycopersicum), es un cultivo con importancia global y un organismo modelo para el estudio del desarrollo de frutos y las respuestas de las plantas al estrés biótico y abiótico. El tomate es afectado severamente por la deficiencia de sulfato, demostrando reducción en su crecimiento, mientras que el transcriptoma de tomate demuestra que la deficiencia de azufre afecta la regulación génica en hojas y raíces de tomate, sin embargo, aún no se conocen los principales TFs que controlan estos cambios regulatorios y su efecto en el fenotipo observado durante este estrés. Utilizando datos públicos disponibles de transcriptómica en tomate (~10,000 bibliotecas de RNA-seq), aplicamos el algoritmo GENIE3 para predecir relaciones regulatorias entre los TFs y sus genes blanco. Estas redes se refinaron integrando redes de co-expresión, predicciones de sitios de unión de TFs y datos de accesibilidad de la cromatina obtenidos de conjuntos de datos reanalizados de ATAC-seq y DNAse-seq. Un análisis de enriquecimiento con datos de ChIP-seq de tomate mostró que las GRNs pueden capturar vías regulatorias relevantes biológicamente. Nuestros hallazgos muestran que, aunque los genes expresados son en su mayoría ubicuos entre órganos, las interacciones regulatorias son altamente específicas en cada órgano. Nuestra GRN de frutos detecto exitosamente los blancos de los TFs TOMATO AGAMOUS-LIKE 1 (TAGL1) y RIPENING INHIBITOR (RIN) cuyo efecto en la maduración frutal esta verificado. Además, analizando la GRN de hojas, se validó las funciones de dos TFs ABA response element binding factor (ABF), el SlABF3 y SlABF5 en la regulación de genes de respuesta a ABA y su correlación con la sequía. Usando las GRNs se logró encontrar dos posibles reguladores a través del análisis de redes, el Solyc03g118290 y Solyc06g063070 sugeridos como posibles reguladores centrales de la maduración frutal, y un TF de la familia bZIP Solyc01g095460, homologo a AtGBF3 como un nuevo regulador de las respuestas al ABA. Utilizamos las GRNs órgano específicas para analizar las respuestas a la deficiencia de sulfato en raíces y hojas de tomate, filtrando las redes para mantener sólo los genes expresados diferencialmente (DEG) identificados previamente. Este enfoque permitió la creación de GRNs contexto-específicas, revelando que las respuestas a la deficiencia de sulfato demuestran mecanismos regulatorios órgano-específicos. Se logró detectar TFs clave asociados a la regulación de la deficiencia de sulfato, incluyendo Solyc05g009720 (HHO) y Solyc08g078340 (KUA1) en raíces, Solyc05g054650 (ZAT11) y Solyc02g071130 (WRKY71) en hojas, y reguladores compartidos como Solyc01g006650 (EIL3), Solyc04g072460 (TGA7) y Solyc10g086530 (SCL14). El SlEIL3 surgió como el candidato más prometedor debido a su papel regulando genes de respuesta a deficiencia de sulfato en las GRNs y su homología con SLIM1, el cual es clave en la deficiencia de sulfato en Arabidopsis. Realizamos un análisis de perturbación denominado TARGET, que identificó los blancos de regulación directa de EIL3 en protoplastos de tomate y reveló una superposición significativa con los DEG en deficiencia de azufre y los blancos predichos de las GRNs. Más del 60% de los genes relacionados a genes de sulfato fueron validados con TARGET, demostrando a SlEIL3 como regulador clave y dando soporte a su elección para experimentos de validación funcional. Para validar la función del SlEIL3, generamos plantas de Arabidopsis thaliana que sobreexpresan este TF (OX-SlEIL3) y las estudiamos bajo tratamientos control (medio MS con todas sus sales) y de deficiencia de sulfato (-S). Las plantas OX-SlEIL3 mostraron un mayor crecimiento, con raíces primarias más largas, áreas foliares más amplias y mayor contenido total de azufre, en ambos tratamientos. El análisis transcriptómico de las plantas OX-SlEIL3 demostró una respuesta genotípica muy similar a tratamientos de deficiencia de sulfato en plantas WT y a plantas sobreexpresoras de SLIM1, también se encontró que SlEIL3, regula genes importantes de respuesta a deficiencia de sulfato, compartidos con SLIM1 como 4 genes Response to Low Sulfur (LSU), un Sulfur Deficiency Induced (SDI), tres genes de metabolización de azufre (APRS2, ATPS1, and APSk3), y cinco genes transportadores SULTRs. Validando nuestra hipótesis debido a que el SlEIL3 se identificó como un regulador clave del metabolismo del sulfato, sentando las bases para desarrollar estrategias que mejoren la eficiencia nutricional y la resiliencia al estrés en tomate. Nuestros hallazgos sugieren que SlEIL3 desempeña un papel fundamental en la regulación de los cambios en la expresión génica provocados por la deficiencia de sulfato en tomate, impulsando el desarrollo de respuestas fenotípicas como represión de crecimiento, la activación de vías de asimilación, metabolización de sulfato y catabolismo de biomoléculas. Los resultados de esta investigación proporcionan una base para estrategias de mejoramiento de cultivos y problemas de estrés en la agricultura. Adicionalmente, demostramos el potencial de las GRNs para identificar nuevos reguladores para dilucidar cascadas regulatorias en respuesta a múltiples condiciones, estadios de desarrollo y tratamientos experimentales en tomate y en otras especies de interés. Las redes regulatorias producidas en este estudio están disponibles como recurso online accesible para la comunidad científica en la plataforma TomatoViz.

El sulfato (forma más disponible del azufre) es un macronutriente esencial requerido para el crecimiento, desarrollo y productividad de las plantas. La deficiencia de sulfato causa reducciones significativas en la biomasa vegetal, afectando la fotosíntesis lo que conlleva a perdidas en el rendimiento agrícola. Mientras que la mayoría de los estudios del transcriptoma enfocados en la deficiencia de sulfato se han centrado en Arabidopsis thaliana, el conocimiento es limitado en especies usadas como cultivos. El tomate (Solanum lycopersicum), es un cultivo con importancia global y un organismo modelo para el estudio del desarrollo de frutos y las respuestas de las plantas al estrés biótico y abiótico. El tomate es afectado severamente por la deficiencia de sulfato, demostrando reducción en su crecimiento, mientras que el transcriptoma de tomate demuestra que la deficiencia de azufre afecta la regulación génica en hojas y raíces de tomate, sin embargo, aún no se conocen los principales TFs que controlan estos cambios regulatorios y su efecto en el fenotipo observado durante este estrés. Utilizando datos públicos disponibles de transcriptómica en tomate (~10,000 bibliotecas de RNA-seq), aplicamos el algoritmo GENIE3 para predecir relaciones regulatorias entre los TFs y sus genes blanco. Estas redes se refinaron integrando redes de co-expresión, predicciones de sitios de unión de TFs y datos de accesibilidad de la cromatina obtenidos de conjuntos de datos reanalizados de ATAC-seq y DNAse-seq. Un análisis de enriquecimiento con datos de ChIP-seq de tomate mostró que las GRNs pueden capturar vías regulatorias relevantes biológicamente. Nuestros hallazgos muestran que, aunque los genes expresados son en su mayoría ubicuos entre órganos, las interacciones regulatorias son altamente específicas en cada órgano. Nuestra GRN de frutos detecto exitosamente los blancos de los TFs TOMATO AGAMOUS-LIKE 1 (TAGL1) y RIPENING INHIBITOR (RIN) cuyo efecto en la maduración frutal esta verificado. Además, analizando la GRN de hojas, se validó las funciones de dos TFs ABA response element binding factor (ABF), el SlABF3 y SlABF5 en la regulación de genes de respuesta a ABA y su correlación con la sequía. Usando las GRNs se logró encontrar dos posibles reguladores a través del análisis de redes, el Solyc03g118290 y Solyc06g063070 sugeridos como posibles reguladores centrales de la maduración frutal, y un TF de la familia bZIP Solyc01g095460, homologo a AtGBF3 como un nuevo regulador de las respuestas al ABA. Utilizamos las GRNs órgano específicas para analizar las respuestas a la deficiencia de sulfato en raíces y hojas de tomate, filtrando las redes para mantener sólo los genes expresados diferencialmente (DEG) identificados previamente. Este enfoque permitió la creación de GRNs contexto-específicas, revelando que las respuestas a la deficiencia de sulfato demuestran mecanismos regulatorios órgano-específicos. Se logró detectar TFs clave asociados a la regulación de la deficiencia de sulfato, incluyendo Solyc05g009720 (HHO) y Solyc08g078340 (KUA1) en raíces, Solyc05g054650 (ZAT11) y Solyc02g071130 (WRKY71) en hojas, y reguladores compartidos como Solyc01g006650 (EIL3), Solyc04g072460 (TGA7) y Solyc10g086530 (SCL14). El SlEIL3 surgió como el candidato más prometedor debido a su papel regulando genes de respuesta a deficiencia de sulfato en las GRNs y su homología con SLIM1, el cual es clave en la deficiencia de sulfato en Arabidopsis. Realizamos un análisis de perturbación denominado TARGET, que identificó los blancos de regulación directa de EIL3 en protoplastos de tomate y reveló una superposición significativa con los DEG en deficiencia de azufre y los blancos predichos de las GRNs. Más del 60% de los genes relacionados a genes de sulfato fueron validados con TARGET, demostrando a SlEIL3 como regulador clave y dando soporte a su elección para experimentos de validación funcional. Para validar la función del SlEIL3, generamos plantas de Arabidopsis thaliana que sobreexpresan este TF (OX-SlEIL3) y las estudiamos bajo tratamientos control (medio MS con todas sus sales) y de deficiencia de sulfato (-S). Las plantas OX-SlEIL3 mostraron un mayor crecimiento, con raíces primarias más largas, áreas foliares más amplias y mayor contenido total de azufre, en ambos tratamientos. El análisis transcriptómico de las plantas OX-SlEIL3 demostró una respuesta genotípica muy similar a tratamientos de deficiencia de sulfato en plantas WT y a plantas sobreexpresoras de SLIM1, también se encontró que SlEIL3, regula genes importantes de respuesta a deficiencia de sulfato, compartidos con SLIM1 como 4 genes Response to Low Sulfur (LSU), un Sulfur Deficiency Induced (SDI), tres genes de metabolización de azufre (APRS2, ATPS1, and APSk3), y cinco genes transportadores SULTRs. Validando nuestra hipótesis debido a que el SlEIL3 se identificó como un regulador clave del metabolismo del sulfato, sentando las bases para desarrollar estrategias que mejoren la eficiencia nutricional y la resiliencia al estrés en tomate. Nuestros hallazgos sugieren que SlEIL3 desempeña un papel fundamental en la regulación de los cambios en la expresión génica provocados por la deficiencia de sulfato en tomate, impulsando el desarrollo de respuestas fenotípicas como represión de crecimiento, la activación de vías de asimilación, metabolización de sulfato y catabolismo de biomoléculas. Los resultados de esta investigación proporcionan una base para estrategias de mejoramiento de cultivos y problemas de estrés en la agricultura. Adicionalmente, demostramos el potencial de las GRNs para identificar nuevos reguladores para dilucidar cascadas regulatorias en respuesta a múltiples condiciones, estadios de desarrollo y tratamientos experimentales en tomate y en otras especies de interés. Las redes regulatorias producidas en este estudio están disponibles como recurso online accesible para la comunidad científica en la plataforma TomatoViz.