Characterization of dicer proteins in fungi

Abstract

Las proteínas Dicer (Dcr) son componentes esenciales de las rutas de interferencia por ARN (RNAi), actuando en el procesamiento de ARN de doble hebra en pequeños ARN que regulan la expresión génica y la estabilidad genómica. Aunque han sido ampliamente caracterizadas en animales y plantas, su diversidad, estructura y evolución en hongos se mantenían escasamente exploradas. En esta tesis, presentamos un análisis exhaustivo de 1,593 proteomas fúngicos anotados, abarcando ocho filos, mediante el cual identificamos 2,917 proteínas Dcr putativas y revelamos un nivel de diversidad estructural y funcional previamente subestimado. Nuestros análisis muestran una alta prevalencia de Dcrs no canónicas, en las que uno o más dominios típicos, como PAZ (Piwi/Argonaute/Zwille), helicasa o el dominio de unión a ARN de doble hebra (dsRBD), no son detectables, lo que sugiere pérdidas recurrentes o una divergencia de secuencia significativa. La reconstrucción filogenética reveló múltiples clados específicos de linaje, con arquitecturas canónicas restringidas mayoritariamente a Mucoromycota y algunos Basidiomycota. En contraste, las formas divergentes dominan en Ascomycota y en linajes fúngicos no-Dikarya, evidenciando una notable flexibilidad evolutiva de los sistemas RNAi en el reino Fungi. Para evaluar si estas Dcrs divergentes conservan su capacidad funcional, aplicamos predicción estructural con AlphaFold y detectamos arquitecturas en forma de “L” y pliegues tipo PAZ conservados incluso en variantes no canónicas. Comparaciones estructurales detalladas mostraron la conservación de residuos clave para la interacción con ARN, particularmente arginina, lisina y ácido glutámico, así como un motivo hidrofóbico altamente conservado (Logo-4), ubicado en una región análoga al conector helicoidal, que probablemente cumple una función estructural crítica. Los análisis de superficie electrostática confirmaron la conservación de canales de unión a ARN, incluso en ausencia de anotaciones canónicas. Además, desarrollamos un modelo HMM informado por estructura (FPAZ.HMM), el cual superó ampliamente a herramientas de anotación convencionales en la detección de regiones PAZ-like en Dcrs fúngicas divergentes, especialmente en linajes no modelo. El análisis de bibliotecas de sRNA provenientes de cepas silvestres y mutantes reveló que incluso Dcrs sin dominios PAZ canónicos pueden generar pequeños ARN, mientras que esta capacidad se pierde al eliminar la proteína. En conjunto, estos resultados desafían las definiciones tradicionales de la maquinaria RNAi basadas exclusivamente en secuencia, demostrando que las Dcrs fúngicas divergentes conservan funcionalidades esenciales mediante la conservación estructural. Proponemos que la integridad estructural, más que la similitud de secuencia es el verdadero determinante funcional en estas proteínas. Este trabajo amplía la comprensión de la evolución de RNAi en hongos y sienta las bases para explorar vías de silenciamiento no canónicas en una amplia gama de sistemas eucarióticos.

Las proteínas Dicer (Dcr) son componentes esenciales de las rutas de interferencia por ARN (RNAi), actuando en el procesamiento de ARN de doble hebra en pequeños ARN que regulan la expresión génica y la estabilidad genómica. Aunque han sido ampliamente caracterizadas en animales y plantas, su diversidad, estructura y evolución en hongos se mantenían escasamente exploradas. En esta tesis, presentamos un análisis exhaustivo de 1,593 proteomas fúngicos anotados, abarcando ocho filos, mediante el cual identificamos 2,917 proteínas Dcr putativas y revelamos un nivel de diversidad estructural y funcional previamente subestimado. Nuestros análisis muestran una alta prevalencia de Dcrs no canónicas, en las que uno o más dominios típicos, como PAZ (Piwi/Argonaute/Zwille), helicasa o el dominio de unión a ARN de doble hebra (dsRBD), no son detectables, lo que sugiere pérdidas recurrentes o una divergencia de secuencia significativa. La reconstrucción filogenética reveló múltiples clados específicos de linaje, con arquitecturas canónicas restringidas mayoritariamente a Mucoromycota y algunos Basidiomycota. En contraste, las formas divergentes dominan en Ascomycota y en linajes fúngicos no-Dikarya, evidenciando una notable flexibilidad evolutiva de los sistemas RNAi en el reino Fungi. Para evaluar si estas Dcrs divergentes conservan su capacidad funcional, aplicamos predicción estructural con AlphaFold y detectamos arquitecturas en forma de “L” y pliegues tipo PAZ conservados incluso en variantes no canónicas. Comparaciones estructurales detalladas mostraron la conservación de residuos clave para la interacción con ARN, particularmente arginina, lisina y ácido glutámico, así como un motivo hidrofóbico altamente conservado (Logo-4), ubicado en una región análoga al conector helicoidal, que probablemente cumple una función estructural crítica. Los análisis de superficie electrostática confirmaron la conservación de canales de unión a ARN, incluso en ausencia de anotaciones canónicas. Además, desarrollamos un modelo HMM informado por estructura (FPAZ.HMM), el cual superó ampliamente a herramientas de anotación convencionales en la detección de regiones PAZ-like en Dcrs fúngicas divergentes, especialmente en linajes no modelo. El análisis de bibliotecas de sRNA provenientes de cepas silvestres y mutantes reveló que incluso Dcrs sin dominios PAZ canónicos pueden generar pequeños ARN, mientras que esta capacidad se pierde al eliminar la proteína. En conjunto, estos resultados desafían las definiciones tradicionales de la maquinaria RNAi basadas exclusivamente en secuencia, demostrando que las Dcrs fúngicas divergentes conservan funcionalidades esenciales mediante la conservación estructural. Proponemos que la integridad estructural, más que la similitud de secuencia es el verdadero determinante funcional en estas proteínas. Este trabajo amplía la comprensión de la evolución de RNAi en hongos y sienta las bases para explorar vías de silenciamiento no canónicas en una amplia gama de sistemas eucarióticos.